Green Fluorescent FAM-FLICA® Caspase-3/7 (DEV

Green Fluorescent FAM-FLICA® Caspase-3/7 (DEVD) Assay Kit

图1。大鼠原级海马神经元细胞死亡。（A） 是 FLICA® FAM-DEVD-FMK （B）、PI （C） 和 Hoechst （D） 的复合。DNA在4个细胞（D）中标记，3个细胞为半胱天冬酶阳性（B）

两个FLICA@阳性细胞也是PI阳性(红色，膜受损)，且处于细胞凋亡晚期而非坏死。

图2。正常(A)和角膜圆锥(B)角膜成纤维细胞用200微米H2O2治疗1小时，清洗后恢复。随后用FAM-DEVD-FMK(编号93/94)处理1小时，然后用1个凋亡洗涤液清洗。接受H2O2处理的角膜圆锥膜成纤维细胞(B)相比正常细胞(A)显示出半胱天冬酶-3/7活性显著增加。非凋亡细胞背景为暗色

在与Les-6287(1.0微米和1.5微米)及DMSO共潜伏24小时后，MCF-7(A，B)和MDA-MB-231(C，D)乳腺癌细胞中半天冬酶3/7活性的流式细胞术分析

Green Fluorescent FAM-FLICA® Caspase-3/7 (DEVD) Assay Kit

我们的FLICA®探针是非细胞毒性的荧光标记CAspa酶抑制剂，能共价结合活性caspase酶。FLICA®测量细胞内凋亡过程，而非副作用，如磷脂酰丝氨suan的更新，并消除了常见于附件V和TUNEL染色方法的假阳性发生率。FLICA®也可用于测量焦凋病，这是一种高度炎症的程序性细胞死亡形式。使用FLICA®时，直接将其加入细胞培养基，培养并清洗。FLICA®是细胞渗透型，能够高效地在所有细胞中扩散。如果细胞内存在活性半胱天冬酶，它会与FLICA®共价结合，并在细胞内保留绿色荧光信号。未结合的FLICA®会在洗涤过程中扩散出细胞。凋亡和焦凋亡细胞会保留更高浓度的FLICA®，并且荧光比健康细胞更明亮。没有前半胱天冬酶或非活性酶形式的干扰。如果检测处理导致细胞凋亡和/或焦凋亡，细胞中半胱天冬酶活性会高于负对照细胞，并通过FLICA®发荧光。凋亡是一种进化保守的程序性细胞过程。它的核心是一系列被称为半天冬酶的蛋白酶级联反应，这些酶会在促凋亡信号时被触发。一旦激活，半胱天冬酶会切割蛋白质底物，最终导致细胞分解。卡斯帕斯已被发现在从秀丽隐杆线虫到人类等多种生物中。哺乳动物半胱天冬酶在凋亡和炎症中扮演着不同角色。在凋亡中，效应半胱天冬酶（-3、-6和-7）负责蛋白水解切割，进而导致细胞分解。起始半胱天冬酶（-8、-9和-10）调控上游的凋亡。Caspase-1与缓凋亡和炎症小体活性相关，并在将前IL-1ß蛋白转化为活性IL-1ß细胞因子过程中扮演关键的酶角色（使用FLICA®套件#98、#9122和#9162检测caspase-1）。请注意，巨噬细胞和单核细胞在激活后能迅速分泌半天冬酶-1。与大多数其他蛋白酶一样，半胱天冬酶作为前体合成，经过蛋白水解成熟，既可自催化，也可由具有相似特异性的酶级联反应。活性半胱天冬酶由两个大亚基（~20 kD）和两个小亚基（~10 kD）组成，它们非共价结合形成两个异二聚体、四聚体活性半胱天期酶。

活化的半天冬酶通过识别必须包含天冬氨酸（D）残基的3或4个氨基酸序列来切割蛋白质。该C端残基是羰基端断裂反应的靶点。每个FLICA®探针包含3或4个氨基酸序列，这些序列被不同的激活半胱天冬酶靶向。该靶序列夹在绿色荧光标记、羧荧光素（FAM）和氟甲基酮（FMK）之间。 Caspase无法切割FLICA®抑制剂探针;相反，它们与目标序列上的FMK形成不可逆的共价键，抑制酶活性。我们的聚半胱天冬酶FLICA®探针FAM-VAD-FMK，可作为多种活化半胱天冬酶识别的细胞凋亡的通用试剂。要更具体地靶向特定半胱天冬酶，可以使用我们的专用FLICA®试剂。我们有检测试剂盒：caspase-1（YVAD或WEHD）（也识别caspases 4和5）、-2（VDVAD）、-3/7（DEVD）、-6（VEID）、-8（LETD）、-9（LEHD）和-10（AEVD）。FLICA®套件也带有红色或远红荧光标签。半胱天泡酶和大多数其他关键细胞生存酶一样，在它们能够识别并切割的目标氨基酸序列上有一定的允许性。因此，尽管FLICA®试剂含有每个半胱天冬酶偏好的不同氨基酸靶序列，但它们也能识别其他活性半胱天冬酶。我们鼓励通过正交技术验证半胱天冬酶活性。FLICA®可用于标记悬浮细胞或粘附细胞及薄组织切片。在用FAM-FLICA®标记后，细胞可以被固定或冷冻。对于标记后将被石蜡嵌入的组织，可以使用我们的红色硫磺胺SR-FLICA®探针;不要使用绿色的FAM-FLICA®探针，因为FAM染料在石蜡嵌合过程中会被淬火。标记FAM-FLICA®的细胞可以用红色活死染色剂如碘化丙苣（FAM-FLICA®套件中含）和7-AAD（目录#6163）等试剂进行对色，以区分凋亡与坏死。核形态可同时通过Hoechst 33342（一种蓝色DNA结合染料，包含于FLICA®套件中）观察。细胞可以直接通过荧光显微镜观察，或者使用流式细胞仪或荧光板读取器定量荧光强度。FAM-FLICA®最佳激发波段为488-492纳米，峰值发射波段为515-535纳米。

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